谱析仪器：高效液相色谱仪梯度洗脱技术及注意事项

高效液相色谱仪的梯度洗脱是指在同一个色谱分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比。梯度洗脱又称梯度淋洗或程序洗脱。
        一、梯度洗脱类型：
        1、高压梯度：采用两台高压输液泵，分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器在泵之后，两种溶液在高压状态下混合。
        2、低压梯度：只需一台高压输液泵，比例阀在泵之前，溶液在常压（低压）下混合。
        二、梯度洗脱实质：
        通过不断地变化流动相的配比和极性来调整混合样品中各组分的k值，使所有色谱带都以最佳平均k值通过高效液相色谱仪色谱柱。梯度洗脱在高效液相色谱仪中所起的作用相当于气相色谱仪中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中样品k值的变化是通过流动相的极性、PH值和离子强度改变来实现的，而不是通过改变温度（温度程序）来实现。

三、梯度洗脱需要注意事项

由于液相色谱仪在进行梯度洗脱时多种溶剂混合组成不断变化，因此可能带来一些特殊问题必须充分引起重视：

1.需要注意溶剂的互溶性，不相溶的溶剂无法被用作梯度洗脱的流动相。溶剂只能在一定比例内混溶，而超出范围后就不会互溶要引起注意。有机溶剂与缓冲液混合时可能会析出盐的晶体为磷酸盐时需要特别小心。

2.梯度洗脱对溶剂纯度的要求更高以保证其良好的重现性。进行试样样品分析前为辨认溶剂杂质峰必须进行梯度洗脱，因为富集在色谱柱头上的弱溶剂的质杂会被强溶剂洗脱下来。应用梯度洗脱的溶剂需要彻底脱气防止其混合时会产生气泡。

3.混合溶剂的粘度会随其组成变化，因此在梯度洗脱时会出现压力的变化。还要注意防止在梯度洗脱过程中超过色谱柱与输液泵能够承受的最大压力。

4.在每次梯度洗脱之后必须对液相色谱仪柱进行再生处理使其恢复到初始状态。需要十到三十倍柱容积的流动相流经液相色谱仪的色谱柱促使固定相与流动相达到完全平衡。

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